1、微生物方法驗證，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。

答：沒有上限。但一般不會高于100%，因為加進去的菌量是一樣的，如果超過100%可看成是操作上的誤差。按微生物的特性，如果不超過太多，是可以接受的，但沒有具體上限。（本所控制在110%以內）。

2、在微生物方法驗證時，霉菌、酵母菌計數(shù)驗證只用黑曲霉及白色念珠菌做方法學驗證，在操作培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)：在玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)生長的白色念珠菌的形態(tài)太小與營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)的細菌的某些形態(tài)大小相同，這樣如何判斷營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落是否是白色念珠菌？為何這兩種菌落形態(tài)相似？

答：菌落形態(tài)相似不等于就是同一種菌。在驗證時，營養(yǎng)瓊脂的驗證菌株為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，如果本底菌為0，則營養(yǎng)瓊脂上長的菌應該不是白色念珠菌。要判斷是否為白色念珠菌，應進行白色念珠菌的相應鑒定方法后才能確定。任何微生物都不可能只是從菌落就可以進行判斷，只能判斷為疑似，然后再做一系列相應的鑒定實驗后才能進行判斷。

3、生孢梭菌的適宜計數(shù)用培養(yǎng)基？（很多驗證需對生孢梭菌進行計數(shù)）

答：zui簡便的方法是用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基上層為含氧層，適宜需氧菌生長，下層為厭氧層（下層高度7cm以上），適宜厭氧菌生長。在培養(yǎng)16~18小時這個時間進行觀察，計數(shù)，超過20小時,由于繁殖量大，培養(yǎng)基將混濁，點計不清。或者是用哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，澆注后，置厭氧罐（袋）里，再置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，計數(shù)。

4、微生物限度檢查法中所用的培養(yǎng)基要進行適用性檢查試驗，請問這些培養(yǎng)基還需要做無菌檢查試驗嗎？

答：微生物限度檢查，藥典上沒有特別說明對培養(yǎng)基作無菌性檢查，但每次都要做陰性對照實驗，陰性對照是檢查整個檢驗系統(tǒng)是否被微生物污染，實際上也包括了培養(yǎng)基的無菌性檢查。

5、微生物限度檢查法中所用的培養(yǎng)基如：營養(yǎng)瓊脂、EMB、Macl等培養(yǎng)基其分裝容器需要預先滅菌嗎？

答：不用。只要是潔凈的就行，因為分裝后還要滅菌。

6、具有抑菌性的供試品，細菌、霉菌、都是用薄膜過濾法來檢查的，那么沙門菌可以用常規(guī)法來檢查嗎？就是可以不經過過濾直接接種到營養(yǎng)肉湯中嗎？

答：這要看你驗證的結果。如果通過驗證，你的品種是對沙門菌有抑制作用，且用培養(yǎng)基稀釋法不能消除其抑菌性，則就必需考慮用薄膜過濾法。

7、微生物限度檢查中，稀釋劑對照組，是在稀釋液中加入50~100cfu的菌，還是把稀釋液制成含量50~100cfu的濃度呢？

答：是把稀釋液制成含50~100cfu/ml菌的濃度。（在這里，我對上次講課時關于稀釋劑對照組操作的PPT進行糾正，對于離心 薄膜過濾法的稀釋劑對照組的操作應該是：含50~100cfu/ml菌的稀釋液     離心    取稀釋液（與試驗組同樣取上層液）    過濾、沖洗    貼平板）

8、稀釋級對照組:含50~100cfu/ml菌稀釋液→離心→取供試液 稀釋液過濾、沖洗→貼平板。這里需要加供試液嗎？是否應為上述離心后的菌液？答：不需要取供試液，只取“上述離心后的菌液"。關于這一情況，我在第7題里已經作了說明。

9、當要做稀釋劑對照組時，是否就是從制備供試品時就同時做一份不含供試品而是含菌50~100cfu的樣品？等于按同一個方法制備一個供試品，五個含菌稀釋液對照組？

答：是的。

10、菌落計數(shù)是否需要將每天計數(shù)的數(shù)據(jù)登記在記錄本上，是否可以只記錄zui終的數(shù)據(jù)？

答：可以。每天計數(shù)的目的是預防菌落彌漫互相覆蓋，干擾zui終的點計。你可以用油性筆將每天點計的數(shù)記錄在培養(yǎng)皿上，發(fā)報告時只要zui終菌落數(shù)就行了。

11、若樣品中有不溶物（如片劑中的輔料顆粒），經常會影響培養(yǎng)前期的結果，藥典要求逐日計數(shù)，所以報告中會出現(xiàn)第二、三日菌落數(shù)小于*日的現(xiàn)象，請問該如何向客戶或監(jiān)檢機構解釋這種結果？或者是否可以不計*、二日菌落數(shù)，待輔料顆粒與菌落可以區(qū)分后再計數(shù)？

答：報告書不需要顯示*、第二天的結果，只需報告zui終結果。理由請見第9題答復?；蛘呤窃跔I養(yǎng)瓊脂中加入TTC試劑（每100ml加入0.1%）

12、由于微生物檢驗的特殊性，對于樣品的微生物限度檢查計數(shù)數(shù)據(jù)是否可登記在表格內（此表格僅含樣品名稱、批號及檢查結果）。之后再將檢測結果移至詳細記錄中？

答：原始記錄應該只有1份。如果你說的詳細記錄是屬于一般記錄，是沒有必要的，如果是指報告書，就應該沒問題。這要看你自己訂的SOP。

13、直接接種法培養(yǎng)后的菌落報告：原液230cfu,稀釋10倍后 40cfu,請問按2010版藥典的菌落數(shù)報告規(guī)則如何報告菌落數(shù)？

答：報告菌落數(shù)為40×10=400cfu。應以菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)后的zui大值作為報告結果。

14、05版藥典供試品離心5分鐘，而10版藥典改用離心3分鐘，原來按5分鐘驗證的產品是否需要重新驗證？

答：是的。需要再確認一下。

15、10版藥典附錄微生物限度檢查法中結果判斷的菌落計數(shù)單位是以“cfu"表示，但正文品種項下是以“個"表示，zui終應以哪位為準呢？

答：應該是以cfu為單位。正文是由于印刷時沒統(tǒng)一修改過來，關于這個問題，在增補本上修訂過來。（在增補本沒出來之前，正文品種還是以個為單位）

16、為何控制菌液的濃度為50-100cfu/ml。

答：50-100cfu在平板上比較好點計，菌落不容易重疊。少于50，則實驗誤差會增大，重現(xiàn)性不好，大于100則容易造成菌落太密或重疊不好計數(shù)。

17、藥典上控制菌檢查的方法驗證，只是說把菌加至增菌培養(yǎng)基中檢出即可，那我們實際做驗證與記錄時，是否要做增菌以后的步驟呢？

答：要。不然你怎么知道檢出來的菌是你加進去的試驗菌呢？

18、采用薄膜過濾法檢驗，陽性菌，計數(shù)是否也用此方法計數(shù)？

答：是的。

19、對于10版藥典延長培養(yǎng)時間，控制菌35-37℃改為30-35℃培養(yǎng)溫度，一些已經驗證（按05版藥典）檢品是否需要重新驗證？是否有必要進行延長時間前后菌生長情況變化的驗證試驗？

答：目前沒有相關性規(guī)定，我們認為可按原來已經驗證的方法，用2010年版的培養(yǎng)時間和溫度再確認一下，如果結果符合藥典要求，則可用。如果不可行，則調整后再進行驗證。

20、若無需都重新驗證，那么參照標準為05版藥典，又可以通過什么文件來更改為參照10版藥典？

答：請看上一題。

21、檢驗控制菌用培養(yǎng)基促生長能力的檢查，也需要對照培養(yǎng)基嗎？例如：大腸埃希菌用的BL增菌液。

答：是的。請看附錄“微生物限度檢查法"中的表2。

22、10版藥典增加貼膏劑的檢查，狗皮貼膏藥屬于貼膏劑嗎？

答：應該是的。請對照《中國藥典》一部附錄P8進行確定。

23、請問若試驗條件限制未能使用勻漿儀制備非規(guī)定滅菌制劑是否可采用溫熱（不超過45℃）的稀釋液？

答：如果能夠充分分散樣品，可以的。

24、請問若采用薄膜過濾法進行驗證，由于過濾難度大，是否可以每膜過濾相當于供試品0.1g，報告以結果乘以10？

答：驗證計數(shù)時可以的，驗證控制菌時檢驗總量應達到藥典要求，如果一張膜檢驗量達不到，可分幾個膜。

25、請問采用靜置分層取上清液薄膜過濾，是否需要加稀釋劑對照組？

答：個人觀點可以不用,但未經驗證。

26、供試品靜置分層取上清液進行試驗，靜置3~5分鐘，是否經過驗證供試品的本底菌不會沉到底部？

答：未經驗證。

27、培養(yǎng)基適用性檢查，抑制能力檢查用菌種是哪些？

答：控制菌的培養(yǎng)基適用性檢查,請看藥典“微生物限度檢查法"中表2，計數(shù)用培養(yǎng)基請看“計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查"。

28、投料中有神曲提取物，限度應界定為多少？

答：不是藥材原粉投料，標準均按“不含藥材原粉的制劑"執(zhí)行。

29、微生物限度檢查里有關經驗類的東西都必須經過驗證才可以使用,那么驗證的內容包括哪些數(shù)據(jù)應記錄，是否也應該有文件與記錄？

答：參照藥典，你是作什么樣的檢驗，就作什么樣的驗證，有驗證就應該有記錄。

30、比如10倍稀釋級菌落數(shù)為0，100倍稀釋級菌落數(shù)為2，按2005年版藥典應以低稀釋級菌落數(shù)報告為＜10，還是按zui高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告為200個/g，是否理解正確？

答：按《中國藥典》2005年版報告應為＜10個/g（或ml），按《中國藥典》2010年版報告應為200cfu/g（或ml）。

31、計數(shù)方法的驗證：執(zhí)行新版藥典是否就延長培養(yǎng)時間做方法驗證？

答：是。

32、平皿法中提到“每個稀釋級每種培養(yǎng)基至少檢驗2ml供試液"，是每皿注2ml還是每皿注1ml？如要做0.5ml或0.2ml，本級是否還需做1ml?答：常規(guī)平皿法時每皿注1ml，做2個皿；培養(yǎng)基稀釋法（即每皿0.5ml或0.2ml）時，供試液總量也應是2ml，每1ml菌落數(shù)合計后，2ml的菌落數(shù)再平均；本級就不需做1ml了，但下一級就只做1ml/皿就行了。

33、在細菌霉菌計數(shù)檢查中，老師提到的每個稀釋級每種培養(yǎng)基至少檢驗2ml供試液，但2010版藥典上并沒有要求要這樣做，那應以哪個做法為準？

答：藥典中對平皿法的描述：平皿法“取供試液1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中，注入15～20ml 溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2 個平板。"這里的描述是以常規(guī)平皿法進行描述的，所以“每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2 個平板"，也就是2ml的量。對于培養(yǎng)基稀釋法，請看藥典供試液的制備中3. (6) ①。

34、10版藥典要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml，（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）是否指20g或20ml樣品中10g或10ml直接用于沙門菌控制檢查，另10g或10ml加pH7.0的緩沖液100ml作為1：10的供試品溶液作為細菌，霉菌，酵母菌的檢驗嗎？還是指20g都用于沙門菌檢查？

答：20g都是用于沙門菌檢查。沙門菌的檢查法是：取3份200ml營養(yǎng)肉湯，其中2份分別加入10g或10ml樣品，取其中1份加入10~100cfu菌液作陽性對照。第3份加入10ml稀釋劑作陰性對照進行檢查，所以。細菌，霉菌，酵母菌檢驗的樣品不包括在這里。

35、沙門菌檢查為10g或10ml，為何一次檢查量又為20g或20ml？（P130）答：其中10g（或10ml）是檢驗用的，另10g（或10ml）是用于陽性對照試驗的。請看上一題目解釋。

36、采用薄膜過濾法時，濾膜采用何種方法滅菌？

答：據(jù)我們經驗，采用一次性過濾器。如果用多次使用的過濾器，則濾膜用濕熱滅菌比較好，因為干熱滅菌后，濾膜較脆，試驗時不容易保證濾膜完整。

37、方法學驗證時，采用平皿法稀釋級計數(shù)，是否要做稀釋級對照組？

答：稀釋級對照組？是指本底菌組嗎？如果是，那就要。因為要平行試驗，才能知道同一稀釋級的本底菌是多少。如果是指稀釋劑對照組，就不用，因為所用的稀釋劑是藥典規(guī)定的，是無毒性的稀釋劑。

38、方法驗證的培養(yǎng)基稀釋法驗證（樣品0.2ml）只做2個平皿，每個平皿的加菌量是多少？如果同步加0.2ml菌，其加菌量就達不到50~100cfu。

答：不管每皿加的供試液的量是多少，每皿加菌液的量都是1ml ,即都是50~100cfu。

39、平皿法（稀釋法）計數(shù)驗證時，取zui低稀釋供試液如0.5ml和50~100cfu試驗菌，那50~100cfu的試驗菌是指50~100cfu還是50~100cfu∕0.5ml？我們是要加1ml還是0.5ml的試驗菌？

答：平皿法（稀釋法）計數(shù)驗證時，每皿要加的菌液是50~100cfu，一般我們配制的菌液濃度是50~100cfu/ml，所以就加1ml。如果你配制的菌液不是這個濃度，你可以折算，只要加的菌數(shù)是50~100cfu/皿就行了。

40、細菌霉菌方法驗證，同時做1ml，0.5ml，0.2ml供試品組及供試品驗證組時，菌液是否也按1ml，0.5ml，0.2ml分別加入？此時1ml，0.5ml，0.2ml供試品驗證組中的菌數(shù)能否也達到50~100cfu？

答：驗證時，不論是1ml，0.5ml，0.2ml的供試液，每皿的加菌量都是50~100cfu，即1ml（如果你配制的菌液濃度是50~100cfu/ml）。

41、培養(yǎng)基稀釋方法驗證，每皿0.2ml，加菌液0.2ml，那么0.2ml的菌液計數(shù)是否在50~100cfu∕0.2ml。

答：請看上一題的解釋。

42、微生物限度檢查霉菌、酵母菌要求不超過100的情況下，這兩種菌是不是要分開來檢，用不同培養(yǎng)基檢測？目前只用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基檢測這兩種菌，有沒有必要修改？

答：按藥典規(guī)定，一般品種是用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基檢測這兩種菌；含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。

43、測表面微生物時，直接接觸藥品與間接接觸藥品的限度（≤25）一致，是否有不妥，如果有不同意見，可否提供其計數(shù)方法？另外，如果檢測到菌落數(shù)超過100以上，那么報告規(guī)則的菌數(shù)也是取兩位有效數(shù)字嗎？

答：“測表面微生物"？這應該是藥包材的檢測標準吧？由于我們尚未開展這項業(yè)務，所以對其標準情況不了解，但既然已經成為標準，就肯定有其合理性，如有不同意見，可向標準制訂部門反映，并提出你認為合理的解決辦法。微生物的報告規(guī)則一般都是取兩位有效數(shù)字。

44、內包裝材料PVC硬片，鋁箔等樣品的微生物檢驗（限度）方法？

答：是藥包材的檢驗？應該有相應的檢驗方法吧！

45、控制菌檢查，大腸埃希菌IMViC試驗，結果顯示未檢出，有沒有硬性規(guī)定必須要進一步鑒定？

答：對于大腸埃希菌檢查，IMViC試驗已經是鑒定試驗了，如果IMViC試驗結果顯示未檢出，那么就可以報告未檢出大腸埃希菌。

46、菌數(shù)報告按兩位有效數(shù)字報告，是按數(shù)字修約方法進行數(shù)據(jù)修約，還是只用保留兩位有效數(shù)字，如菌數(shù)為364報告菌數(shù)為360，還是370；若菌數(shù)為3670報告菌數(shù)應為多少？

答：修約原則是4舍6入5留雙。即菌數(shù)為364報告菌數(shù)為360；若菌數(shù)為3670報告菌數(shù)應為3700；如果是3650，則報告菌數(shù)應為3600。

47、在日常檢驗中控制菌檢驗方法通過驗證的控制菌檢驗可否不做陽性對照？理解：在驗證時已做過控制菌 供試液，驗證時供試液對控制菌無抑菌性，若只是做控制菌（不加供試液）則在培養(yǎng)基適用性時已證明培養(yǎng)基的質量，那么每次試驗做陽性對照的意義是什么？或者陽性對照試驗怎么做？

答：從理論上來說是可以的，驗證試驗實際上就是檢驗時的陽性對照試驗。但藥典要求控制菌檢查時必需同時從陽性對照和陰性對照，這應該是考慮到檢驗過程的檢驗系統(tǒng)的誤差吧。本人認為，生產廠家對自己的產品在經驗證后，檢驗時如果每天同一產品批量很大，可以只做一個陽性對照，但對于藥檢所則必須每批都做，因為對于同一品種，不同廠家其生產工藝不盡相同，在檢驗過程中對被檢微生物的干擾也不同。因此，藥檢所應每批都做。

48、取樣量藥典要求“從2個以上zui小包裝單位中抽取供試品"，是否包括2個？

答：包括。

49、請問藥廠自行做的微生物方法驗證是否需要經過藥檢所的審核？若產品更改為輔料，重新做方法驗證，是否需要到藥檢所備案或需要藥檢所審核？

答：藥廠自行做的微生物方法驗證不需要經過藥檢所的審核。同樣，重新驗證后也不需要。但如果你的檢品需要報注冊檢驗，則你必需提供你的整個驗證資料，藥檢所將根據(jù)情況對你的方法進行確認，看方法是否可行。

50、是否每次做培養(yǎng)基適用性都必須與對照培養(yǎng)基進行比較？如果*批培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基比較回收率為90%，那么第二批培養(yǎng)基與*批培養(yǎng)基比較回收率為80%，則折算為第二批培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基比較回收率為72%，之后購買的培養(yǎng)基與前一批比較，而不用每次培養(yǎng)基適用性都與對照培養(yǎng)基比較，這樣可不可行？

答：請按藥典要求做，至于內部控制則要自己掌握。但你要保證*批培養(yǎng)基在你用于與第二、第三批比較時，質量保持其與對照培養(yǎng)基比較時一樣，因為隨著時間的推移，培養(yǎng)基的質量肯定有所下降。

51、微生物檢驗驗證時，如我用一瓶普通脫水培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基測定菌落數(shù)，如普通脫水培養(yǎng)基符合適用性檢查，那么該瓶普通脫水培養(yǎng)基能否作為以后工作中的對照培養(yǎng)基來用？

答：請看上一題的解釋。

52、培養(yǎng)時間有要求24~48h，也有要求24~72h的，像這種時間要求范圍比較大的情況，如果在zui短的時間內（如：24h）就已經長菌，但需進行后續(xù)實驗判斷該菌是否為控制菌，那么，是否需要培養(yǎng)到zui長時間（如：48h或72h）再進行后續(xù)實驗？

答：長勢好的話可以進行后續(xù)實驗不用等到zui長時間。

53、操作結果的RSD%的范圍比較寬裕，是否可信？（eg：黑曲霉若＞20cfu∕皿時，菌落將擴散至難以分離，所以回收率度較低）

答：這個問題要具體問題具體分析。菌落漫延，這是要求逐日觀察的主要原因之一，應在菌落能分辨的時候點計菌落數(shù)。加菌量太少，容易出現(xiàn)誤差大，重現(xiàn)性差，所以要求加的菌數(shù)在50~100cfu。

54、含藥材細粉的膠囊如何制備供試液？

答：按固體制劑供試液的制備方法制備，可用45℃水浴軟化溶解膠囊殼。

55、大腸菌群檢查，需陽性對照嗎？

答：要的。陽性對照菌為大腸埃希菌。

56、菌液涂布時，用接種棒還是涂布棒涂？

答：用L型涂布棒，也可用玻棒自制。

57、控制菌的培養(yǎng)基促生長能力檢查，對照菌加于固體培養(yǎng)基如何涂布，用什么工具來涂布？

答：請看上一題。

58、三部藥典中有些產品細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)用每g多少cfu，但有些為每g多少個，應怎樣記錄？

答：應該是cfu才對的，這些應該是在轉版時沒轉過來吧，在增補本應該會轉過來。但是在沒轉過來之前，它還是法定的，必需按藥典上的寫法來執(zhí)行。

59、如樣品的控制菌為大腸埃希菌沒檢出，但檢出其它種菌，結果該怎樣判定？

答：如果是其他致病菌，請看微生物限度檢查法的結果判斷*句。

60、我們是做糖衣片的，微生物限度檢查吸取供試液時，吸管有時會被粉末塞住，那能不能讓供試液沉淀后取其上清液呢？這樣操作結果可靠嗎？

答：請將藥片盡可能打碎，如果還不能解決問題，我們的經驗是：可讓大藥渣沉降后取上層液進行試驗，但沉降時間盡可能短(在3-5分鐘內)，這樣做對結果會有一定影響，但應該在可接受范圍內。

61、微生物限度檢查控制菌檢查時，如供試液的增菌后無菌生長，可否直接發(fā)供試液的未檢出控制菌，此時，陽性對照試驗還需繼續(xù)做下去嗎？

答：只要能判定供試液增菌后無菌生長，陽性對照試驗菌長出，就可發(fā)未檢出控制菌。

62、如何理解“菌落蔓延成片不以計數(shù)"？如10-1級有1個皿的菌落成片是否用10-2級來計數(shù)？

答：是的。

63、如何避免菌落成片？

答：1、培養(yǎng)基傾注時溫度不宜過高，可減少傾注后培養(yǎng)皿里的水蒸汽太多而造成菌落容易漫延，或者加蓋“陶瓦蓋"吸收水蒸汽；2、細菌計數(shù)時，在每100ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入滅菌的1%氯化四氮唑0.1ml，可使生成的菌落變紅色，容易點計，也可在一定程度上抑制菌落漫延。

64、請問一下對于生長速度快、易蔓延的菌有什么好的方法控制，該如何計數(shù)，如采用陶瓦蓋培養(yǎng)時間要不要延長？

答：請看上一題的說明。如用陶瓦蓋，培養(yǎng)時間不需要延長。

65、請問若細菌、酵母菌平均菌落數(shù)不在其宜選取的范圍內，即大于300及100cfu時，該如何報告菌數(shù)？另05版藥典的規(guī)定范圍是30~300/30~100，倘若當菌落數(shù)大于300及100，如何報告？

答：應該重新試驗，將稀釋級再往進一步稀釋，直到能有可報告的稀釋級?？稍诠ぷ髦幸詫Ξa品的認識將稀釋級調整到可報告的級別進行檢驗。

66、請問對于抑菌性難以消除的粉末狀樣品，采用的消除抑菌性的方法是什么？

答：如果能溶于水，目前來說，的除菌方法是薄膜過濾法；其次是找到相應的中和劑。

67、我們生產的產品為外用搽劑非無菌產品，需要對所有原輔料做微生物限度檢查嗎？

答：生產企業(yè)對原輔料的微生物限度檢查，應根據(jù)自己的情況進行控制。參見一部附錄P88（或二部附錄P116），微生物限度標準 第7點。（個人意見：如果所用的原輔料直接投料，就要控制，如果還要進一步提取等，則可通過控制中間產品的微生物限度來控制。）

68、原輔料是否要單獨做方法驗證？

答：所有要檢查微生物限度的品種（當然包括原輔料），都要做方法驗證。

69、中藥材的微生物限度如何檢測？如超標應如何控制？

答：1.中藥材的微生物限度檢查，參照固體制劑的供試液制備，并根據(jù)給藥途徑執(zhí)行標準，如用于直接投料至口服制劑的，還應檢大腸菌群。2.如超標，具體問題具體分析。

70、中間產品可否不做微生物檢測？

答：中間產品應該控制微生物限度，各企業(yè)應內部質控相關的具體要求。

71、廠家用10-2稀釋級作驗證，那我們藥檢所作檢查時是否從10-2稀釋級開始做？

答：是的。

72、省所做微生物限度時，廠家沒有做驗證，那省所是自己做驗證，還是退回去？又或者廠家的控制菌驗證沒有做全（例如漏了沙門菌沒做），那省所怎么處理？

答：1、如果是注冊檢驗，廠家沒有做驗證，我們是不會接收樣品的，也就是說，沒做驗證或驗證不全，肯定退回去。 2、如果是委托檢驗，由于是協(xié)議性質，我們就按協(xié)議進行檢驗。

73、微生物限度檢查時，只有細菌數(shù)不合格，那么復試是否可以只做細菌數(shù)檢查就行了？

答：可以。

74、樣品制備中，如羧甲淀粉鈉等崩解劑遇水膨脹，經試驗1g∕100ml仍為膠體漿糊狀，無法過濾且難與培養(yǎng)基融合，再加大稀釋倍數(shù)，則代表量太少，請問這種輔料采用何種方法進行微生物限度檢查？

答：羧甲淀粉鈉應該沒有抑菌作用，無法過濾可用平皿法進行檢查，且供試液制備時，稀釋劑的溫度適當調低些。

75、若樣品對微生物生長有促進性，采用薄膜過濾法應如何消除此影響，或者有什么其他方法可以消除促進性以獲得更準確結果？

答：采用薄膜過濾法就是很好的消除影響的方法；藥典上規(guī)定“供試液從制備到加入檢驗用培養(yǎng)基不得超過1個小時"，就是考慮到樣品對微生物存在促進或者抑制作用的影響。因此要獲得更準確的結果，就必需盡量縮短從供試液的制備到加入培養(yǎng)基的時間。另外，也可根據(jù)樣品的特性有針對性的加入中和劑等。

76、控制菌檢查對于大腸的檢查，MUG試驗中顯陽性或難以判斷時，“將培養(yǎng)液轉接到EMB"，這里的培養(yǎng)液是指MUG還是之前擴增的BL？

答：藥典上并沒有“將培養(yǎng)液轉接到EMB"這一描述。但對于MUG和靛基質試驗結果不一致時，是這么規(guī)定的：“如MUG 陽性、靛基質陰性，或MUG 陰性、靛基質陽性，則應取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24 小時。"

77、膽香鼻炎含有豬膽汁膏，毛雞藥酒含有毛雞浸出夜，霍膽丸含豬膽粉，這三個產品需要檢沙門菌嗎？

答：是的。（因含豬膽汁膏、毛雞、豬膽粉）。

78、微生物檢驗時，勻漿機應把轉速調到多少才不會對微生物有損傷？

答：沒有相關的規(guī)定，目前一般使用轉速為3000-4000轉/分鐘。

79、如果使用藥典以外的培養(yǎng)基進行微生物限度檢查（比如TSA），怎么進行培養(yǎng)基適用性檢查，是否有合適的對照培養(yǎng)基？

答：可以參照“藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則"對所用培養(yǎng)基的質量進行控制。至于是否有相應的對照培養(yǎng)基，要看中檢所是否來得及研制。

80、微生物限度檢查的方法驗證，至少應進行3次獨立平行試驗，每個獨立平行試驗可否使用不同批號的樣品？

答：可以，且是用3個不同批號樣品進行驗證。

81、每個獨立的平行試驗是否有必要用3個不同批號的樣品進行驗證？

答：用3個不同批號的樣品進行驗證，可以增加驗證結果的重現(xiàn)性。

82、微生物限度檢查中，培養(yǎng)基的適用性檢查時對每個批號的培養(yǎng)基進行還是對每次制備好的培養(yǎng)基進行？

答：請看《藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則》中，關于培養(yǎng)基第3點，質量控制試驗的描述：“除藥典附錄另有規(guī)定外，在實驗室中，若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查試驗可只進行一次。如果培養(yǎng)基的制備過程未經驗證，那么每一批培養(yǎng)基均要進行適用性檢查試驗，試驗的菌種可根據(jù)培養(yǎng)基的用途從相關附錄中進行選擇，也可增加從生產環(huán)境及產品中常見的污染菌株。"

83、能否舉例說明哪些培養(yǎng)基是指示能力檢查培養(yǎng)基？

答：請看“微生物限度檢查法"中表2。

84、05版SOP中有說經驗證后控制菌可以不用做陽性對照，10版是否有相同的說法？已建立控制菌方法是否還需作陽性對照？

答：藥典規(guī)定，控制菌檢查必需同時檢查陽性對照和陰性對照。05版SOP《中國藥品檢驗標準操作》中并沒有說經驗證后控制菌可以不用做陽性對照，不知你所說的是那個SOP？

85、請問化藥軟膠囊還需要檢沙門菌嗎？

答：如果是口服制劑、有動物藥投料就必需檢查。

86、微生物方法驗證過程中，供試液的制備，檢細菌與霉菌及酵母菌處理不一樣，這樣方法是否能成立？

答：*有可能。檢查方法是經驗證的，對于有抑菌作用的品種，經驗證后細菌計數(shù)方法與霉菌及酵母菌的檢查方法不一樣，這很正常，只要方法是經驗證，符合藥典要求就可以。

87、2010版藥典控制菌培養(yǎng)溫度降低到30~35℃，那么以2005版藥典驗證過程控制菌檢驗方法，2010版藥典還需要再驗證嗎？

答：是的。

88、檢大腸埃希菌時，MUG觀察一定要5小時觀察，是否可以只在24h觀察？

答：可以。

89、培養(yǎng)基適用性檢查涂布時如何考慮（或消除）涂布棒上沾到菌落的影響？

答：涂布時，試驗用培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基都同樣操作，所以這個影響是同等的，可不需考慮。

90、純化水要多少ml過濾，是不是原液要不要沖洗液沖洗？要不要陰性對照？

答：過濾多少ml可根據(jù)樣品微生物污染的程度來決定，只要zui終每膜上的菌落不超過點計要求（即100cfu）就行了，結果報告時將菌落數(shù)除以ml數(shù)即可。可以不用沖洗。必需做陰性對照。

91、用稀釋法檢驗控制菌的時候，金黃色葡萄球菌是10ml（相當1g，1ml）至500ml肉湯，能否用2ml至100肉湯？

答：可以，但應該同時做5份，使檢驗用的樣品總量達到1g（或1ml）。

92、保留2倍有效數(shù)字（細菌，霉菌報告數(shù)）如果檢出細菌是1160cfu/g，是否報告數(shù)必須寫成1.1*103cfu/g，還是直接寫1/100（不過這樣好像不是2倍有效數(shù)字）。

答：報告數(shù)應該寫成1.2Χ103cfu/g或1200cfu/g。

93、怎么證明微生物限度中加入的表面活性劑，中和劑或滅活劑的生長和存活無毒性？是在驗證中做稀釋劑對照組就可證明是否其無毒性了嗎？還是？

答：是的，在驗證中做稀釋劑對照組就可證明是否其無毒性。

94、平皿稀釋法時，若每一個平皿加入0.5ml供試液，那么，陰性也是加0.5ml嗎？還是陰性加1ml？

答：陰性是檢驗檢測系統(tǒng)是否受微生物污染的試驗，應該是取1ml稀釋液。

95、輔料中的香精（如楊梅香精），滑石粉是否按非水溶性制劑供試品處理？氫氧化鈉又如何處理呢？

答：香精和滑石粉，如果能分散于水中，或者加表面活性劑后能分散于水中就可以，不一定非要按非水溶性制劑制備供試液。氫氧化鈉可溶于水，可按普通檢品檢驗進行驗證處理。

96、有兩種制劑形式的原料藥該如何制定衛(wèi)生學指標呢？如一種原料藥可用于口服制劑以及外用制劑？

答：可以按要投料的劑型進行控制，或者直接按要求嚴格的一種來要求。